Адресная доставка яда грибов к раковым клеткам

Таргетная терапия рака – современный подход в онкологии. Для этого используются сложные в изготовлении и дорогостоящие моноклональные антитела и разрабатываются конъюгаты антитело-лекарство. Другой подход подразумевает создание конъюгатов малых молекул – обычно пептидов или пептидомиметических лигандов – с лекарственными средствами. В настоящее время ведутся разработки конъюгатов грибного токсина, α-аманитина, с пептидами, связывающимися с рецепторами раковых клеток. В обзоре рассмотрены современное состояние исследований в данной области.

Использование моноклональных антител (mAbs) в качестве терапевтических средств для лечения злокачественных опухолей вошло в клиническую практику более 20 лет назад [1]. Сегодня онкологическая помощь немыслима без арсенала mAbs, одобренных для лечения солидных опухолей, лейкемий и лимфом. Несмотря на этот успех, все еще существуют ограничения в отношении противоопухолевой активности mAbs, поэтому продолжаются попытки дальнейшего повышения эффективности терапии антителами. Такие стратегии включают конъюгацию mAbs с радионуклидами, слияние с белковыми токсинами (иммунотоксинами) или соединение с небольшими молекулами лекарств (конъюгаты антитело-лекарство, ADC). Смысл создания ADC заключается в том, чтобы объединить селективную нацеливающую способность mAbs путем специфического связывания с опухолеассоциированными антигенами с цитотоксическим действием небольших молекулярных препаратов или токсинов. Ковалентное соединение малой молекулы лекарства с макромолекулой, такой как IgG, обеспечивает обогащение токсином опухолевых клеток, одновременно щадя нецелевые ткани, повышение растворимости гидрофобных соединений и увеличение периода полураспада в плазме за счет предотвращения почечного клиренса, что в целом приводит к расширению терапевтического окна. В природе и синтетической химии известны мириады клеточных токсинов, но лишь немногие ядовитые вещества и еще меньше способов действия признаны пригодными для концепции ADC, поскольку токсин, используемый в качестве полезной нагрузки ADC, должен сочетать в себе следующие непростые свойства [2]:

1. Цитотоксический потенциал полезной нагрузки должен быть чрезвычайно высоким, поскольку ограниченное проникновение IgG в опухоль, низкая экспрессия антигенов, неэффективная интернализация (проникновение лиганда, связанного с рецептором, внутрь клетки) и метаболизм линкера могут привести к очень концентрациям токсина в клетке. Известно, что на грамм опухоли локализуется всего 0,0003–0,08 % введенной дозы антител, что подчеркивает необходимость в токсинах, которые достигают клеточной гибели при максимально низких концентрациях. Поэтому полезные нагрузки, воздействующие на клеточные мишени, которые участвуют в фундаментальных процессах жизнедеятельности клеток и присутствуют только в малом количестве копий, обеспечат высокую цитотоксическую активность в генетически гетерогенной среде опухолевой ткани и предотвратят избегание раковых клеток с помощью любого механизма сопротивления.

2. Мишень полезной нагрузки должна быть расположена внутри клетки, так как большинство современных стратегий ADC зависят от интернализации конъюгатов токсинов, начиная с эндоцитоза комплекса ADC-антиген, лизосомальной деградации антитела или линкера и, наконец, высвобождения полезной нагрузки в цитоплазму клетки. Многие сильнодействующие токсины микроорганизмов, растений и животных действуют на клетки извне, например, на клетки нейронов, блокируя ионные каналы, или нарушают свертываемость крови, и поэтому не подходят для использования в качестве полезной нагрузки ADC.

3. Молекулярная структура полезной нагрузки должна быть небольшой по размеру, тем самым снижая риск иммуногенности, также она должна обладать разумной растворимостью в водных средах для облегчения конъюгации с антителами. Наконец, она должна обладать достаточной стабильностью в плазме, учитывая длительный период полураспада препаратов антител в циркуляции. Несмотря на ограниченные структурные возможности, токсин должен допускать конъюгацию линкера. А при использовании нерасщепляемого линкера – сохранять токсический потенциал даже при связывании с белковым фрагментом после деградации антитела, например, в виде конъюгата с лизином или в виде тиолового производного после внутриклеточного восстановления дисульфидной связи.

Использование ингибиторов транскрипции, таких как аматоксины, является новым направлением в области технологии ADC.

Альтернативным подходом к таргетной (целевой) терапии являются конъюгаты малых молекул с лекарственными средствами (SMDC), в которых малая молекула – обычно пептид или пептидомиметический лиганд рецептора – позволяет избежать недостатков ADC, таких как высокая стоимость производства, неблагоприятная фармакокинетика (низкая диффузия в ткани и недостаточная скорость накопления) и возможное провоцирование иммунного ответа [3]. Путем конъюгации со специфическим лигандом клеточного мембранного рецептора токсин может быть доставлен в опухолевый очаг и введен в раковые клетки.

В 2013 году впервые сконъюгировали α-аманитин с pHLIP (пептид вставки с низким уровнем pH) через линкеры различной гидрофобности [4]. Результаты показали, что pHLIP может доставлять α-аманитин в клетки и вызывать их гибель через 48 ч в результате опосредованного pH прямого проникновения через мембрану и последующего расщепления дисульфидного линкера в цитоплазме клетки. В другом примере конъюгировали N-пропаргиласпаргиновый аналог аманитина с cycloRGD лигандом интегринов (cyclo[RGDfK]) [5]. Конъюгаты были протестированы на клеточной линии глиобластомы U87, но наблюдалось лишь незначительное повышение токсичности по сравнению с α-аманитином.

Рисунок 1 – Структура α-аманитина

α-Аманитин

(Alfa-amanitine, α-amanitine α-Amatoxin; CAS 23109-05-9) представляет собой бициклический октапептид, который относится к большой группе токсинов, известных как аматоксины, протоплазматических грибов. Среди содержащих токсины видов грибов – бледная поганка (Amanita phalloides), а также мухомор весенний (Amanita verna) и вонючий (Amanita virosa), галерина окаймлённая (Galerina) и др. Эти виды грибов производят α-аманитин в количестве, достаточном для отравления взрослого человека с фатальным повреждением печени и летальным исходом (LD₅₀, перорально 0,1 мг/кг). В экспериментальных исследованиях метаболиты яда не обнаружены. Это означает, что аматоксины не подвергаются биотрансформации [6].

α-Аманитин является самым смертоносным микотоксином, обнаруженным в роде Amanita. Проглатывание ядовитых аманитов в некоторых случаях приводит к летальному исходу. Пептид остается активным после нагревания (приготовления пищи) и в сушеных грибах.

Аманитин — пептидный токсин ядовитых грибов

Структура аматоксинов была выяснена в 1960-ых годах Виландом [7]. Девять известных на сегодняшний день аматоксинов природного происхождения имеют одинаковую бициклическую структуру: кольцо из восьми аминокислот с L-конфигурацией, соединенное между остатками триптофана и цистеина сульфоксидным мотивом. Три боковые цепи в аматоксинах гидроксилированы, причем группы OH отвечают за выраженную растворимость в воде и, по крайней мере частично, за связывание с молекулой-мишенью. Все макроциклические аматоксины (β, γ, ε,..) содержат остаток триптофана с атомом серы в положении2индольного кольца [8]. Аманитин является наиболее распространенным токсином в аманитах и самым токсичным [9]. В 1966 году впервые описали, как α-аманитин ингибирует синтез РНК в ядрах печени мыши [10].

α-Аманитин убивает клетки, ингибируя РНК-полимеразу II (Pol II) и выключая транскрипцию генов, блокируя инициацию и элонгацию транскрипции. Частота транслокации РНК-полимеразы II на ДНК под действием токсина снижается с нескольких тысяч до нескольких единиц нуклеотидов в минуту [11, 12]. В результате РНК-полимераза II остается «неподвижной» во время транскрипции. Таким образом α-аманитин практически блокирует синтез всех белков в организме. РНК-полимераза II из клеток млекопитающих, рыб и насекомых очень чувствительна к токсину.

Аматоксины быстро всасываются, и человека аматоксины обнаруживаются в моче через 90–120 минут после приема. Также установлено, что аматоксины не связываются с белками плазмы [6], основной путь их выведения – через почки. [13].

Благодаря своему механизму действия, α-аманитин также широко используется в качестве инструмента в научных исследованиях в области молекулярной биологии и в биологических экспериментах. Его можно применять для определения того, какие формы РНК-полимеразы присутствуют в клетках. Затем проверяется чувствительность полимеразы в присутствии токсина: РНК-полимераза I нечувствительна, РНК-полимераза II высокочувствительна, а РНК-полимераза III умеренно чувствительна [14].

α-Аманитин нашел применение в конъюгатах, сочетающих лекарственный препарат и антитело (ADC). Немецкая фармацевтическая компания Heidelberg Pharma, GmbH ведет разработки новой технологии конъюгатов на основе α-аманитина. Такие вещества в пикомолярных (10^-12 моль) концентрациях продемонстрировали высокую активность по отношению к опухолевым клеткам, устойчивым к терапии, в частности, к тем, которые экспрессируют транспортеры с множественной лекарственной устойчивостью, к инициаторам онкогенеза опухоль и неделящимся клеткам.

Характерный для α-аманитина механизм действия придает его конъюгатам подходящую полезную токсическую эффективность [15]. Переносимость и терапевтическая область применения ADC с α-аманитином изучены на различных моделях онкозаболеваний грызунов и низших приматов. Кроме того, конъюгаты α-аманитина имеют низкую склонность к агрегации в водных и физиологических средах, даже в высоких соотношениях лекарственного средства по отношению к антителу [16, 17].

Конъюгаты α-аманитина

Трансмембранный рецептор αVβ3 интегринов широко экспрессируется на кровеносных сосудах некоторых видов рака человека (например, рака молочной железы, глиобластомы, опухоли поджелудочной железы, карциномы простаты), но не на сосудах здоровых тканей, и поэтому представляет собой подходящую терапевтическую мишень для конъюгатов малых молекул с лекарственными средствами. Интегрин αVβ3 распознает эндогенные лиганды по трипептиду аргинин-глицин-аспартат (RGD), а также по родственной последовательности изоаспартат-глицин-аргинин (isoDGR). Многие синтетические пептиды или пептидомиметики, содержащие эти последовательности, показали наномолярные значения IC₅₀ для связывания αVβ3 интегрина. За последнее десятилетие был разработан ряд циклических лигандов RGD и iso-DGR, содержащих бифункциональный дикетопиперазиновый (DKP) каркас. Среди них cyclo[DKP-RGD] 1 [18] и cyclo[DKP-isoDGR] 3 [19] показали сродство связывания с очищенным рецептором αVβ3 в наномолярном диапазоне и хорошую селективность к этому интегрину по сравнению с интегрином αVβ5 – в 33–34 раза (Рис. 2).

Рисунок 2 – Структуры веществ из работы [20]

Кроме того, эти лиганды ингибируют сигнальный каскад FAK (киназа фокальной адгезии) и Akt (протеинкиназа B) и процесс инфильтрации опухолевых клеток, выступая в качестве истинных антагонистов интегринов [21].

Лиганды 1 и 3 были также функционализированы аминометильной группой для конъюгации с цитотоксическими препаратами (Рис. 2, лиганды 2 и 4) [22-24]. Синтезированы конъюгаты лигандов 2 и 4 с паклитакселом (PTX) через 2′-карбамат с молекулярным спейсером и лизoсомно расщепляемым линкером Val-Ala [25] (Рис. 2, cyclo[DKP-RGD]-Val-Ala-PTX 5 и cyclo[DKP-isoDGR]-Val-Ala-PTX 6). Их способность нацеливаться на опухоль была оценена in vitro в антипролиферативных тестах при сравнении αVβ3-позитивной и αVβ3-негативной клеточных линий. Cyclo[DKP-isoDGR]-Val-AlaPTX конъюгат 6 показал высокий индекс нацеливания (TI = 9,9), особенно по сравнению с близкородственным cyclo[DKP-RGD]-Val-Ala-PTX конъюгатом 5 (TI = 2,4) [24].

В работе [20] сообщили о синтезе и биологической оценке двух конъюгатов cyclo[DKP-RGD]-α-аманитин и трех – cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитин. В этих конъюгатах лиганды интегринов связаны с α-аманитином двумя различными линкерами: «нерасщепляемой» шестиуглеродной алифатической цепью (Рис. 2, соединения 7 и 8) и лизoсомно расщепляемым линкером Val-Ala, связанным со спейсером (Рис. 2, соединения 9, 10 и 11). Для всех конъюгатов проведены сравнительные анализы связывания рецепторов αVβ3 интегринов и клеточной пролиферации с положительной (U87) и двумя αVβ3 отрицательными клеточными линиями (A549 и MDA-MB-468).

Конъюгаты 7–11 оценивали на способность ингибировать связывание биотинилированного витронектина с очищенным рецептором αVβ3. Рассчитанные полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC₅₀) приведены на рисунке 2. Скрининговые анализы проводились путем инкубации иммобилизованного рецептора интегринов с растворами конъюгатов cyclo[DKP-RGD]-α-аманитина и cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитина 7–11 в различных концентрациях (от 10^-12 до 10^-5 М) в присутствии биотинилированного витронектина (1 мкг/мл) и измерения связанного витронектина.

Было обнаружено, что cyclo[DKP-RGD]-α-аманитин конъюгаты 7 и 9 и cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитин конъюгаты 8, 10 и 11 сохраняют хорошее сродство к αVβ3 интегрину, в том же диапазоне, что и свободные лиганды. Эти результаты побудили авторов провести анализ жизнеспособности клеток в αVβ3-позитивных и αVβ3-негативных клеточных линиях, чтобы изучить способность конъюгатов избирательно воздействовать на αVβ3-экспрессирующие опухолевые клетки.

Антипролиферативную активность конъюгатов оценивали на трех клеточных линиях, экспрессирующих различные уровни αVβ3-интегрина. Клетки U87 (глиобластома человека) были выбраны как αVβ3-позитивные, а клетки A549 (карцинома легких человека) и MDA-MB-468 (аденокарцинома молочной железы) использовались как αVβ3-негативные. Экспрессию αVβ3-интегрина на клеточной мембране оценивали с помощью проточной цитометрии. Клеточные линии обрабатывали различными концентрациями свободного α-аманитина и конъюгатов 7–11 в течение 96 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CellTiterGlo 2.0; рассчитанные IC₅₀ показаны в таблице 1.

Таблица 1– Оценка антипролиферативной активности α-аманитина и α-аманитиновых конъюгатов 7–11 в отношении U-87, MDA-MB-468 и A549.

Конъюгат cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитин, содержащий лизoсомно расщепляемый линкер Val-Ala 10, оказался в 2,4–3,1 раза более мощным, чем α-аманитин, в клеточной линии U87 (αVβ3+), а также в линиях A549 и MDA-MB-468 (αVβ3-). Конъюгат cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитин, содержащий лизoсомно расщепляемый линкер Val-Ala и спейсер PEG-4 11, оказался в 2,1–2,8 раза эффективнее, чем α-аманитин, в отношении клеточных линий U87 (αVβ3+) и MDA-MB-468 (αVβ3-), в то время как в клеточной линии A549 (αVβ3-) он был в 1,4 раза менее мощным, чем свободный токсин.

Cyclo[DKP-RGD]-нерасщепляемый-α-аманитин (7), cyclo[DKPisoDGR]-нерасщепляемый-α-аманитин (8) и cyclo[DKP-RGD]Val-Ala-α-аманитин (9) оказались менее мощными, чем α-аманитин, во всех клеточных линиях (см. таблицу 1). В целом, можно сделать вывод, что «нерасщепляемые» соединения 7 и 8 гораздо менее цитотоксичны, чем свободный α-аманитин, в то время как лизoсомно расщепляемые конъюгаты 9–11 показывают различные результаты, причем RGD-содержащее соединение 9 ведет себя хуже, чем свободный препарат, но лучше, чем соответствующий нерасщепляемый конъюгат 7. Мотив isoDGR дает в целом лучшие результаты, причем 10 и 11 ведут себя намного эффективнее, чем соответствующий нерасщепляемый конъюгат 8 и несколько лучше, чем свободный препарат. По-видимому, для всех конъюгатов α-аманитина нет прямой корреляции между цитотоксичностью и экспрессией αVβ3-интегрина.

Чтобы определить, регулируется ли повышенная цитотоксичность cyclo[DKPisoDGR]-α-аманитиновых конъюгатов 10 и 11 процессом связывания и интернализации, опосредованным интегрином, были проведены эксперименты по конкуренции, в которых конъюгаты 10 и 11 тестировались на U87 (αVβ3+, αVβ5+, αVβ6-, α5β1+) и на клетках MDA-MB-468 (αVβ3-, αVβ5+, αVβ6+, α5β1-) в присутствии 50-кратного избытка циленгитида (экспериментальный противораковый препарат) с целью блокирования интегринов на поверхности клеток. При использовании клеточной линии U87 наблюдалось скромное увеличение IC₅₀ конъюгата 11 с 91 нМ (без циленгитида) до 143 нМ (с избытком циленгитида). На клеточной линии MDA-MB-468 более выраженное увеличение IC₅₀ происходило для конъюгатов 10 (с 47 нМ без циленгитида до 259 нМ с избытком циленгитида) и 11 (с 65 нМ без циленгитида до 340 нМ с избытком циленгитида). Из этих результатов становится видно, что корреляция между экспрессией интегринов αVβ3 и цитотоксичностью не прослеживается. Однако следует отметить, что эти клеточные линии сверхэкспрессируют другие интегрины (α5β1 в U87, αVβ6 в MDA-MB-468 и αVβ5 в обеих). Таким образом, увеличение IC₅₀ конъюгатов 10 и 11 (до 5,5 раз), возможно, связано с блокированием других интегринов избытком циленгитида, который, как известно, эффективно связывает не только αVβ3 (IC₅₀ = 0,6 нМ), но и αVβ5 (IC₅₀ = 8,4 нМ), αVβ6 (IC₅₀ = 82,8 нМ) и α5β1 (IC₅₀ = 14,9 нМ).

В данной работе показано, что конъюгаты сохраняют хорошее сродство к αVβ3 рецептору, в том же диапазоне, что и соответствующие свободные лиганды. На всех линиях раковых клеток cyclo[DKP-isoDGR]-α-аманитин, конъюгат 10, оказался более мощным, чем α-аманитин, в то время как конъюгат 11 показал повышенную эффективность по сравнению со свободным препаратом только на клетках двух типах клеток. Цитотоксичность конъюгатов увеличивается в три раза по сравнению с α-аманитином.

Заключение

Конъюгаты аманитин представляют собой новый подход к разработке противораковых препаратов. Сочетание пептидного и токсического компонентов ведет к повышению эффективности связывания с целевыми рецепторами и улучшению антипролиферативных свойств. Однако цитотоксичность препарата, сочетающего лиганд интегринов с α-аманитином гораздо хуже, чем у конъюгатов антитело-α-аманитин, для которых увеличение цитотоксичности достигает 100–100000 раз [16]. Таким образом, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы, интегратин-нацеленные конъюгаты все еще далеки от клиники и даже не достигли доклинических исследований на животных.

Работы в данной области находятся на ранних стадиях и продолжаются [26, 27]. Разрабатываются новые конъюгаты и способы их синтеза, варьируются линкеры и лиганды. Кроме того, осуществляются попытки введения в конъюгаты химически модифицированного α-аманитина – 5′-гидрокси-6′-дезоксиаманитин [27]. В целом, эксперименты в настоящее время сосредоточены на разработке и оптимизации синтетических путей к конъюгатам аманитина с пептидами-лигандами интегрина, а также на первичной проверке их биологической активности in vitro.

1. Scott, A.M., Wolchok, J.D., Old, L.J., Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer, 2012. 12(4): p. 278-287. DOI: 10.1038/nrc3236.

2. Anderl, J., Faulstich, H., Hechler, T., Kulke, M., Antibody-drug conjugate payloads. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2013. 1045: p. 51-70. DOI: 10.1007/978-1-62703-541-5_4.

3. Krall, N., Scheuermann, J., Neri, D., Small Targeted Cytotoxics: Current State and Promises from DNA-Encoded Chemical Libraries. Angewandte Chemie International Edition, 2013. 52(5): p. 1384-1402. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201204631.

4. Moshnikova, A., Moshnikova, V., Andreev, O.A., Reshetnyak, Y.K., Antiproliferative Effect of pHLIP-Amanitin. Biochemistry, 2013. 52(7): p. 1171-1178. DOI: 10.1021/bi301647y.

5. Zhao, L., May, J.P., Blanc, A., Dietrich, D.J., Loonchanta, A., Matinkhoo, K., Pryyma, A., Perrin, D.M., Synthesis of a Cytotoxic Amanitin for Biorthogonal Conjugation. ChemBioChem, 2015. 16(10): p. 1420-1425. DOI: https://doi.org/10.1002/cbic.201500226.

6. Faulstich, H., Talas, A., Wellhöner, H.H., Toxicokinetics of labeled amatoxins in the dog. Archives of Toxicology, 1985. 56(3): p. 190-194. DOI: 10.1007/BF00333425.

7. Wieland, T., Peptides of poisonous Amanita mushrooms. 2012: Springer Science & Business Media.

8. Vetter, J., Toxins of Amanita phalloides. Toxicon, 1998. 36(1): p. 13-24. DOI: https://doi.org/10.1016/S0041-0101(97)00074-3.

9. Wienland, T., Faulstich, H., Fifty years of amanitin. Experientia, 1991. 47(11): p. 1186-1193. DOI: 10.1007/BF01918382.

10. Fiume, L., Stirpe, F., Decreased RNA content in mouse liver nuclei after intoxication with alpha-amanitin. Biochimica et biophysica acta, 1966. 123(3): p. 643-645. DOI: 10.1016/0005-2787(66)90239-5.

11. Chafin, D.R., Guo, H., Price, D.H., Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. The Journal of biological chemistry, 1995. 270(32): p. 19114-19119. DOI: 10.1074/jbc.270.32.19114.

12. Rudd, M.D., Luse, D.S., Amanitin greatly reduces the rate of transcription by RNA polymerase II ternary complexes but fails to inhibit some transcript cleavage modes. The Journal of biological chemistry, 1996. 271(35): p. 21549-21558. DOI: 10.1074/jbc.271.35.21549.

13. Jaeger, A., Jehl, F., Flesch, F., Sauder, P., Kopferschmitt, J., Kinetics of amatoxins in human poisoning: Therapeutic implications. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology, 1993. 31(1): p. 63-80. DOI: 10.3109/15563659309000374.

14. Meinecke, B., Meinecke-Tillmann, S., Effects of alpha-amanitin on nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. J Reprod Fertil, 1993. 98(1): p. 195-201. DOI: 10.1530/jrf.0.0980195.

15. What are Antibody-drug Conjugates? 2019; Available from: https://www.adcreview.com/the-review/what-are-antibody-drug-conjugates/.

16. Moldenhauer, G., Salnikov, A.V., Lüttgau, S., Herr, I., Anderl, J., Faulstich, H., Therapeutic Potential of Amanitin-Conjugated Anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule Monoclonal Antibody Against Pancreatic Carcinoma. JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 2012. 104(8): p. 622-634. DOI: 10.1093/jnci/djs140.

17. Hechler, T., Kulke, M., Mueller, C., Pahl, A., Anderl, J., Abstract 664: Amanitin-based antibody-drug conjugates targeting the prostate-specific membrane antigen. Cancer Research, 2014. 74(19 Supplement): p. 664. DOI: 10.1158/1538-7445.AM2014-664.

18. Marchini, M., Mingozzi, M., Colombo, R., Guzzetti, I., Belvisi, L., Vasile, F., Potenza, D., Piarulli, U., Arosio, D., Gennari, C., Cyclic RGD Peptidomimetics Containing Bifunctional Diketopiperazine Scaffolds as New Potent Integrin Ligands. Chemistry – A European Journal, 2012. 18(20): p. 6195-6207. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201200457.

19. Mingozzi, M., Dal Corso, A., Marchini, M., Guzzetti, I., Civera, M., Piarulli, U., Arosio, D., Belvisi, L., Potenza, D., Pignataro, L., Gennari, C., Cyclic isoDGR Peptidomimetics as Low-Nanomolar αvβ3 Integrin Ligands. Chemistry – A European Journal, 2013. 19(11): p. 3563-3567. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201204639.

20. Bodero, L., López Rivas, P., Korsak, B., Hechler, T., Pahl, A., Müller, C., Arosio, D., Pignataro, L., Gennari, C., Piarulli, U., Synthesis and biological evaluation of RGD and isoDGR peptidomimetic-α-amanitin conjugates for tumor-targeting. Beilstein J Org Chem, 2018. 14: p. 407-415. DOI: 10.3762/bjoc.14.29.

21. Panzeri, S., Zanella, S., Arosio, D., Vahdati, L., Dal Corso, A., Pignataro, L., Paolillo, M., Schinelli, S., Belvisi, L., Gennari, C., Piarulli, U., Cyclic isoDGR and RGD Peptidomimetics Containing Bifunctional Diketopiperazine Scaffolds are Integrin Antagonists. Chemistry – A European Journal, 2015. 21(16): p. 6265-6271. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201406567.

22. Colombo, R., Mingozzi, M., Belvisi, L., Arosio, D., Piarulli, U., Carenini, N., Perego, P., Zaffaroni, N., De Cesare, M., Castiglioni, V., Scanziani, E., Gennari, C., Synthesis and Biological Evaluation (in Vitro and in Vivo) of Cyclic Arginine–Glycine–Aspartate (RGD) Peptidomimetic–Paclitaxel Conjugates Targeting Integrin αVβ3. Journal of Medicinal Chemistry, 2012. 55(23): p. 10460-10474. DOI: 10.1021/jm301058f.

23. Dal Corso, A., Caruso, M., Belvisi, L., Arosio, D., Piarulli, U., Albanese, C., Gasparri, F., Marsiglio, A., Sola, F., Troiani, S., Valsasina, B., Pignataro, L., Donati, D., Gennari, C., Synthesis and Biological Evaluation of RGD Peptidomimetic–Paclitaxel Conjugates Bearing Lysosomally Cleavable Linkers. Chemistry – A European Journal, 2015. 21(18): p. 6921-6929. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201500158.

24. Zanella, S., Angerani, S., Pina, A., López Rivas, P., Giannini, C., Panzeri, S., Arosio, D., Caruso, M., Gasparri, F., Fraietta, I., Albanese, C., Marsiglio, A., Pignataro, L., Belvisi, L., Piarulli, U., Gennari, C., Tumor Targeting with an isoDGR–Drug Conjugate. Chemistry – A European Journal, 2017. 23(33): p. 7910-7914. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201701844.

25. Alberto Dal, C., Luca, P., Laura, B., Cesare, G., αvβ3 Integrin-Targeted Peptide/Peptidomimetic-Drug Conjugates: In-Depth Analysis of the Linker Technology. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2016. 16(3): p. 314-329. DOI: http://dx.doi.org/10.2174/1568026615666150701114343.

26. Panzeri, S., Arosio, D., Gazzola, S., Belvisi, L., Civera, M., Potenza, D., Vasile, F., Kemker, I., Ertl, T., Sewald, N., Reiser, O., Piarulli, U., Cyclic RGD and isoDGR Integrin Ligands Containing cis-2-amino-1-cyclopentanecarboxylic (cis-β-ACPC) Scaffolds. Molecules, 2020. 25(24). DOI: 10.3390/molecules25245966.

27. Pryyma, A., Matinkhoo, K., Wong, A.A.W.L., Perrin, D.M., Meeting key synthetic challenges in amanitin synthesis with a new cytotoxic analog: 5′-hydroxy-6′-deoxy-amanitin. Chemical Science, 2020. 11(43): p. 11927-11935. DOI: 10.1039/D0SC04150E.