Лекарственные белки и пептиды быстро деградируют в организме. ПЭГилирование (PEGylation) – присоединение фрагмента полиэтиленгликоля, способствующие сохранению и продолжительной циркуляции терапевтических препаратов в организме, защищая их от механизмов разрушения ксенобиотиков. PEG обеспечивает длительный период полураспада и улучшает другие фармацевтические свойства белков и пептидов. Благодаря этому ПЭГилированные белки и пептиды можно вводить во много раз реже, чем их незамещенные формы. Полиэтиленгликоль является безвредным, не иммуногенным, не антигенным, хорошо растворимым в воде и одобренным для медицинского применения полимером. ПЭГилирование играет важную роль в системах доставки лекарств и повышает их терапевтический потенциал. В обзоре рассмотрены история, принцип, особенности и преимущества ПЭГилирования, причины его применения и известные ограничения подхода, а также избранные биологически активные ПЭГилированные белки и пептиды.
Лекарственные макромолекулы
Белки и пептиды обладают высокой эффективностью и специфичностью по сравнению с низкомолекулярными веществами благодаря тому, что их структура близка к природным соединениям. В то же время, это представляет собой большое препятствие в разработке систем доставки макромолекул – белки и пептиды быстро разрушаются и выводятся из крови. Для того чтобы доставить адекватные концентрации вводимых терапевтических препаратов в ткани-мишени, эти материалы должны циркулировать в кровотоке достаточно долго, что требует подходов для увеличения времени циркуляции.
Из-за таких ограничивающих факторов, как большая молекулярная масса, гидрофильная природа, инактивация под действием ферментов и склонность к агрегации, биодоступность вводимых белков или пептидов обычно низка [4]. Наиболее изученные стратегии для улучшения различных путей доставки и стабилизации препаратов в организме следующие. Усилители проницаемости – это наиболее распространенный подход к доставке белков [2]. Также применяют биоадгезивные полимерны, пролекарства (неактивные молекулы, которые в организме превращается в активное вещество [5]). Подход с миметическими пептидами задействует т. н. параллельные пептиды – молекулы с аномальным расположением синтезированных аминокислот или включением вставок между ними. Применяют также липидирование [2], липосомальную инкапсуляцию, микро- и нанокапсулирование, и твердые липидные наночастицы – на их основе разработан инсулин для перорального введения [6].
Ковалентная конъюгация белков с различными полимерами дает преимущество в виде более широкого спектра возможных боковых цепей, что приводит к изменению растворимости, липофильности, активности, кристалличности и вкуса. В связи с этим фармацевтические и биотехнологические компании проводят многочисленные исследования и тестируют новые методы, чтобы найти идеальную модификацию. Короткие цепи хитозана и полиэтиленгликоля (PEG) представляют собой наиболее используемые конъюгаты (т. е., искусственно получаемые гибридные молекулы), поскольку они решают проблему низкой растворимости и улучшают стабильность лекарств. Модификацию препаратов фрагментами PEG мы рассмотрим подробнее.
История применения PEG
Рисунок 1 – Структура PEG и метокси-производного
Полиэтиленгликоль (поли(оксиэтилен), polyethylene glycol, PEG, PEG, C2nH4n+2On+1; CAS 25322-68-3) является наиболее широко используемым и одобренным FDA полимером для доставки лекарств [7]. Считается, что первыми сообщениями о применении ПЭГилирования для доставки лекарственных средств стали работы от 1977 года Дэвиса и Абуховски, в которых описано ковалентное присоединение PEG к бычьему сывороточному альбумину и белкам каталазы печени [8, 9]. Исследователи обнаружили, что, оптимизировав место и степень ПЭГилирования, они могут увеличить время системной циркуляции и снизить иммуногенность белков без существенного понижения активности. В 1990 году FDA одобрило первый ПЭГилированный белковый продукт, Adagen®, фермент аденозиндеаминазы для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита [10]. С тех пор FDA разрешило к применению десяток других ПЭГилированных белковых препаратов для лечения различных заболеваний – от ревматоидного артрита до возрастной макулярной дегенерации.
Успех ПЭГилирования белков как метода получения более длительно циркулирующих и, следовательно, более эффективных терапевтических агентов привел в 1980–1990-ых годах к исследованиям ПЭГилирования наночастиц для системного применения. PEG-покрытия на наночастицах защищают поверхность от агрегации, опсонизации и фагоцитоза, тем самым продлевая время циркуляции. Первое одобрение FDA продукта, содержащего ПЭГилированные наночастицы, Доксил®, было получено в 1995 году. Липосомы Doxil «Stealth®» увеличили биодоступность доксорубицина почти в 90 раз через одну неделю после введения по сравнению со свободным препаратом, при этом период полураспада препарата составил 72 часа, а период полураспада в циркуляции – 36 часов [11].
PEG и ПЭГилирование
По своей сути, ПЭГилирование (в русском языке одинаково часто встречается термин «пегилирование») – это ковалентное присоединение молекулы PEG к молекуле белка или пептида, для повышения ее эффективности. Полиэтиленгликоль, практически не ядовит, не иммуногенен, не антигенен по своей природе, хорошо растворим в воде [12]. ПЭГилированные составы обладают многочисленными преимуществами: более длительное пребывание в организме, подавление деградации под действием метаболических ферментов, снижение элиминации белка. ПЭГилирование отвечает за повышение терапевтического потенциала лекарств за счет увеличения времени их циркуляции, снижает иммуногенность и антигенность препаратов, таким образом стабилизируя препараты. Оно также помогает увеличить гидродинамический размер лекарств и снижает их почечный клиренс.
Свойства полиэтиленгликоля
Полиэтиленгликоль – это линейный или разветвленный полимер с простыми эфирными и гидроксильными группами (Рисунок 1). Его получают из окиси этилена в процессе анионной полимеризации, которая инициируется нуклеофильной атакой гидроксильных ионов на эпоксидный цикл. Большая часть применения приходится на метокси-PEG (Рисунок 1). Конъюгация полиэтиленгликоля и биомолекулы находится в зависимости от стерических препятствий, молекулярного веса, химической структуры, а также от реакционных способностей как молекулы-субстрата, так и самого полимера. Чтобы провести ПЭГилирование лекарственной молекулы, последняя должна нести подходящие функциональные группы, к которым относятся карбоксильная, гидроксильная, тиольная или аминогруппа.
Идеальный PEG-реагент отвечает следующим критериям: он должен являться монодисперсным по своей природе или иметь индекс дисперсности, близкий к 1,00; иметь доступность одной функциональной группы, предназначенной для присоединения молекулы лекарства; не быть ядовитым и иммуногенным.
Преимущества ПЭГилирования
Преимущество метода конъюгации PEG с лекарственными средствами заключается в увеличении периода полураспада препарата без нарушения его терапевтической активности, что является основным способом улучшения терапевтического потенциала соединения с PEG. Это происходит за счет повышения гидрофильности и снижения скорости гломерулярной фильтрации в почках [12].
PEG отлично растворим в воде, поэтому ПЭГилированная молекула демонстрирует лучшую растворимость. Также изменяется распределение в организме. В природе полиэтиленгликоль относится к небиодеградируемым полимерам. Известно, что PEG с молекулярным весом около 20 кДа выводится в основном через почечную систему, но более тяжелые полимеры выводятся путем экскреции с фекальными массами.
Эта техника используется для создания разнообразных конъюгатов с ферментами, аптамерами, низкомолекулярными препаратами, антителами, белками и находит клиническое применение в биофармацевтической промышленности. Наночастицы PEG применяют при лечении рака. PEG-наночастица показывает более высокую эффективность при меньшей дозе препарата. PEG-модификация снижает иммуногенность, уменьшает стерические препятствия для молекулы лекарства, увеличивая его нацеливаемость. PEG-модифицированные белки или пептиды более эффективны, чем немодифицированные. ПЭГилирование олигонуклеотидов может повысить растворимость, устойчивость к нуклеазе и улучшить проницаемость клеточной мембраны.
Механизм ПЭГилирования
Для ПЭГилирования используются как линейные, так и разветвленные цепи PEG. В центральном ядре разветвленного PEG содержится две молекулы полимера на ядре хлортриазина, через которое он конъюгирует с молекулами лекарств. ПЭГилирование с разветвленными цепями дает лучшие результаты в PEG-конъюгации. Для модификации белков используется монофукциональный полиэтиленгликоль. ПЭГилирование осуществляется путем добавления PEG к N-концевой аминогруппе, лизина, цистеина и других аминокислот, в зависимости от конкретного белка [13].
Методы ПЭГилирования бывают двух типов: случайное ПЭГилирование и сайт-специфическое ПЭГилирование. В процессе случайного ПЭГилирования возникает набор позиционных изомеров. Если функционально реактивный участок расшит, то в некоторых случаях терапевтическая активность теряется. Чтобы избежать этой проблемы, перед ПЭГилированием необходимо удалить все посторонние загрязняющие белки, пептиды или другие соединения, так как они также могут участвовать в ПЭГилировании
Во избежание избыточного связывания один конец полимера во время конъюгации закрывается метоксигруппой. Такой синтетический полимер полностью растворяется в водных или органических средах. Монометокси-PEG образуется в аналогичном незамещенному PEG процессе, но с катализом метоксидом. Монометокси-PEG наиболее подходит для конъюгации с полипептидами [14]. На сегодняшний день доступны различные производные полиэтиленгликоля, которые отличаются по структуре и молекулярному весу.
Иногда PEG-конъюгация влияет на терапевтическую активность лекарств. Эта проблема может быть решена с помощью концепции обратимого ПЭГилирования. Обратимое ПЭГилирование предполагает присоединение лекарства к производным PEG. Высвобождение препарата происходит путем ферментативного, гидролитического расщепления связи in vivo с заранее определенной кинетической скоростью в течение некоторого времени.
Процедура ПЭГилирования может применяться для липосом, пептидов, углеводов, ферментов, фрагментов антител, нуклеотидов, малых органических молекул и для различных наночастиц.
Полиэтиленгликоль в области диагностики
Особенности полиэтиленгликоля также были использованы в диагностике [12]. Полиэтиленгликоль играет важную роль и применяется для обнаружения заболеваний in vivo с помощью магнитного резонанса или радиоактивности. Для диагностики, PEG вводится в хелатной форме с добавлением соединений, которые обеспечивают лучшее биораспределение и стабильность. Благодаря ПЭГилированию увеличивается время циркуляции хелатов, которые будут выводиться из кровотока почками или печенью более плавно, чем немодифицированные молекулы, что позволяет получать более качественные изображения с помощью магнитного резонанса. Биораспределение при радиодиагностики значительно изменяется в случае антител C225-PEG-радиометаллических хелаторов, в которых полиэтиленгликоль действует как линкер между целевыми и диагностическими молекулами. C225 представляет собой моноклональное антитело, направленное против рецептора эпидермального фактора роста, которое конъюгировано с гетеробифункциональным PEG, несущим хелатор радиоактивных металлов (диэтилентриаминпентауксусная кислота, DTPA) на одном конце. Конъюгат DTPA-PEG-C225 сохраняет 66% необходимого сродства и, кроме того, при мечении индием-111 демонстрирует более узкую доставку в устойчивом состоянии, чем не ПЭГилированный Indium-111-DTPA-C225, из-за снижения неспецифического связывания. Таким образом, ПЭГилирование полезно в диагностической области.
Полиэтиленгликоль действует как макромолекулярный транспортер для фосфинового хелатного медиатора технеция (Tc), в котором происходит окислительно-восстановительная реакция пертехнетата 99mTcO4- с атомом фосфора фосфинового мотива для получения желательной хелатной формы TcO3+. Эта реакция упрощает процесс радиоактивного мечения, поскольку позволяет избежать необходимости во внешнем восстановителе, который должен быть отделен перед введениемin vivo. Окислительно-восстановительная реакция протекает благодаря наличию ковалентной связи между полиэтиленгликолем и фосфином, и из-за его амфифильной природы; препарат образует мицеллы после растворения в воде, что катализирует реакцию.
Полиэтиленгликоль и олигонуклеотиды
Олигонуклеотиды – это короткие молекулы ДНК или РНК, имеющие широкий спектр применения. Действуя in vivo, они имеют короткий период полураспада из-за низкой стабильности к экзо- и эндонуклеазам, и быстро выводятся из-за своего малого размера. Диффузии в клетку препятствует отрицательный заряд ионизированной формы олигонуклеотидов. Разрабатываются рецептуры олигонуклеотидов для эффективной и безопасной доставки лекарств. И здесь PEG играет важную роль в системе адресной доставки перпаратов. Полиэтиленгликоль присоединяется к гидроксильной группе нуклеиновой кислоты (непосредственно или с помощью пространственного линкера) для повышения устойчивости к действию ферментов и продления срока жизни в плазме [12]. Диффузия в клетки увеличивается за счет маскировки отрицательного заряда олигонуклеотидов. Аптамер, покрытый PEG, 28-мерный аптаниб (Pegaptanib), уже одобрен FDA для лечения возрастной макулярной дегенерации сетчатки. В этой формуле разветвленный полиэтиленгликоль массой 40 кДа присоединен к олигонуклеотидам с помощью пент-аминолинкера [15].
Другие варианты применения PEG
В медицине PEG является основой нескольких слабительных средств (например, Мовикол, Mira lax, Дульколакс и во многих других препаратах), которые играют важную роль в очищении кишечника. Такие средства дают пациентам в случае запланированной операции или колоноскопии. На рынке известны несколько слабительных препаратов с PEG для кратковременного избавления от запоров, например, Goletely, Glycol ax и Nulytely [12].
При присоединении к различным терапевтическим средствам, PEG уменьшает клиренс препаратов из крови, что приводит к длительному действию. Это в конечном итоге увеличивает интервал дозирования лекарства. Например, ПегИнтрон (PEG-конъюгат рекомбинантного интерферона альфа-2b) и Пегасис (ПЭГилированный интерферон альфа-2а) используются для лечения гепатита С, Сомаверт (пэгвисомант) – для лечения акромегалии. PEG используется в получении моноклональных антител путем слияния В-клеток с клетками миеломы. Полиэтиленгликоль выступает в качестве инертного наполнителя в различных лекарственных препаратах. Он также используется для облегчения слияния аксонов при повреждении периферических нервов и спинного мозга.
Благодаря гидрофильному характеру, полиэтиленгликоль используется для пассивирования предметных стекол микроскопов при изучении флуоресценции во избежание неспецифического прикрепления белков. Полимер применяется в качестве смазочного покрытия для различных поверхностей в водной и неводной атмосфере, для создания повышенного осмотического давления в биохимии и экспериментах с биомембранами, особенно в методах осмотического стресса. PEG выступает в качестве полярной неподвижной фазы в газовой хроматографии. Он используется в масс-спектрометрии как внутреннеий калибровочный стандарт.
В биологии PEG вводят в качестве загустителя при исследовании клеток. Он действует как осадитель для разделения плазмидной ДНК и кристаллизации белка. PEG подходит для образования гибридом путем слияния двух разнородных клеток, например, В-клеток и миеломы, которые в дальнейшем используются для образования антител. В области микробиологии PEG действует как концентрирующий вирусы агент. В банках крови полиэтиленгликоль служит в качестве потенцирующего препарата для улучшения обнаружения антигенов с помощью антител.
Утвержденные ПЭГилированные фармацевтические продукты
К настоящему времени значение ПЭГилированных конъюгатов признано официально. Несколько классов лекарственных препаратов производятся в ПЭГилированной форме. Основные примеры приведены в таблице 1 [12].
Таблица 1 – Список утвержденных ПЭГилированных препаратов, доступных на рынке.
| Название | PEG-конъюгат | Путь введения | Год выпуска | Применение в медицине |
| Adagen | PEG-аденозиндезаминаза | В/М | 1990 | Тяжелое комбинированное иммунодефицитное заболевание |
| Oncaspar | PEG-аспарагины | В/В, В/М | 1994 | Острый лимфобластный лейкоз |
| Pegintron | PEG-интерферон альфа2а | П/К | 2000 | Гепатит С |
| Pegasys | PEG-интерферон альфа2а | П/К | 2002 | Гепатит С |
| Neulasta | PEG-G-CSF Химиотерапия | П/К | 2002 | Лечение нейтропении во время химиотерапии |
| Somavert | PEG-HGH антагонист | П/К | 2002 | Акромегалия |
| Macugen | PEG-аптамер | ИВИ | 2004 | Возрастная мышечная дегенерация |
| Micera | PEG-EPO | В/В, П/К | 2007 | Анемия, связанная с хроническим заболеванием почек |
| CimziaTM | PEG-анти-TNF Fab | П/К | 2009 | Ревматоидный артрит |
| Puricase | PEG-уриказа | В/В | 2010 | Подагра |
| Sylatron | PEG-альфа-интерферон 2b | П/К | 2011 | Меланома |
| Omontys | PEG-гинезатид | В/В, П/К | 2012 | Анемия, связанная с хроническими заболеваниями почек |
| Movantik | PEG-налоксол | П/О | 2014 | Нераковые запоры, вызванные опиодами |
| Jintrolong | PEG-соматотропин | П/К | 2014 | Гормон роста |
| Plegridy | PEG-интерферон бета-la | П/К | 2014 | Рассеянный склероз |
| Adynovate | PEG-альфапегол | В/В | 2016 | Гемофилия А |
| Rebinyn | PEG-коагуляционный фактор IX | В/В | 2017 | Гемофилия А |
| Revcovi | PEG-аденозиндеаминаза | В/М | 2018 | Тяжелый комбинированный иммунодефицит аденозиндеаминазы |
| Asparlas | PEG-аспарагины | В/В | 2018 | Острый лимфобластный лейкоз |
| Ziextenzo | PEG-G-CSF | В/В | 2019 | Инфекция во время химиотерапии |
| Esperoct | PEG-коагуляционный фактор IX | В/В | 2019 | Гемофилия А |
Сокращения: В/В – внутривенно, В/М – внутримышечно, П/К подкожно, П/О – перорально, ИВИ – интравитреально (в стекловидное тело глаза)
ПЭГилированные лекарственные белки
Пегадемаза бычья
ПЭГилированная бычья аденозиндеаминаза (PEG-ADA, pegademase bovine; Adagen®, Enzon Inc.) пегадемаза бычья; Adagen®, Enzon Inc.) стала первым ПЭГилированным белком, одобренным FDA в 1990 году в качестве заместительной терапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) [16]. Бычья аденозиндезаминаза, фермент, удаляющий токсичные метаболиты аденозина из крови, была произвольно модифицирована PEG массой 5 кДа для увеличения времени ее пребывания в плазме во много раз, до 3–6 дней, по сравнению с ~1 часом для ADA, и снижения иммуногенности. Благоприятные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики конъюгата позволяют вводить его один раз в неделю подкожно пациентам с ТКИД, отменяя необходимость многократных переливаний крови и, следовательно, избегая связанного с этим риска вирусных инфекций. Это стало важной вехой в технологии ПЭГилирования и стимулировало ее дальнейшее применение [17].
Пэгаспарагиназа
Вторым биологически активным белком, конъюгированным с PEG, была L-аспарагиназа (пэгаспаргаза; Oncaspar®, Enzon Inc.), также являющаяся ферментом. Пэгаспаргаза была одобрена FDA в 1994 году для пациентов, у которых немодифицированный белок вызывал аллергическую реакцию. Конъюгация с несколькими нитями PEG 5 кДа увеличивает период полувыведения примерно в три раза – до 5,3–5, дней – по сравнению с нативным белком, для которого этот показатель составляет 6,4–22,1 час, в зависимости от способа введения. ПЭГилированный продукт был столь же эффективен, как и нативный, при лечении пациентов с острой лимфобластной лейкемией, но с более низкой иммуногенностью [18]. К сожалению, методы, используемые для ПЭГилирования бычьей аденозиндезаминазы и L-аспарагиназы, основаны на неселективном присоединении полимера. Это приводит к образованию гетерогенных составов с различной степенью ПЭГилирования и изомеров, что может отражаться в изменчивости фармакокинетического поведения. Из таких продуктов готовят более однородные препараты.
Пэгфилграстим
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (G-CSF) является основным регулятором гранулопоэза in vivo и имеет фармацевтическое значение для стимуляции пролиферации, дифференцировки и выживания клеток гранулоцитарной линии [19]. Рекомбинантный G-CSF (филграстим) представляет собой белок массой 18,7 кДа, состоящий из 174 аминокислот, лишенный гликозилирования [20]. G-CSF имеет относительно короткий период полураспада (3,5–3,8 часа), поэтому требуются многократные ежедневные дозы. PEG-конъюгированная форма, пэгфилграстим (Neulasta®, Amgen Inc.), получена путем специфического присоединения молекулы PEG массой 20 кДа к α-аминогруппам N-концевого остатка метионина филграстима путем восстановительного алкилирования белка альдегидом PEG в кислых условиях. Пэгфилграстим остается в плазме крови достаточно долго, 15–80 часов, что позволяет делать одну подкожную инъекцию на курс химиотерапии, а не нескольких, необходимых для неконъюгированного белка. Пэгфилграстим остается в кровотоке в течение длительного времени и стимулирует пролиферацию нейтрофилов [21]. Пэгфилграстим также имеет пониженную скорость агрегации в физиологических условиях и не дает нерастворимого осадка с потерей биологической активности, в отличие от нативного G-CSF.
Интерфероны
Интерфероны в сочетании с пероральным рибавирином являются наиболее часто используемыми препаратами для лечения вирусных инфекций и клеточно-пролиферативных заболеваний. Однако стандартные интерфероны имеют короткий период полураспада (4–5 часов) и не обнаруживаются в крови через 24 часа. Поэтому для минимизации интервалов, в течение которых концентрация белка достаточно низка, чтобы вирус мог реплицироваться и развивать устойчивость, требуется инъекционное введение препарата три раза в неделю. Плазменные уровни ПЭГилированного интерферона, однако, поддерживаются на постоянном уровне в течение нескольких дней, обеспечивая постоянную противовирусную защиту. В настоящее время коммерчески доступны два различных PEG-интерферона.
PEG-интерферон-α-2b (PEG-IFNa-2b; PegIntron®, ScheringPlough Corporation) был получен путем ковалентного связывания IFNα-2b с PEG-SC массой 12 кДа через уретановую связь, причем цепь PEG прикреплена в основном к His34 [22]. Эта связь в плазме гидролитически нестабильна, поэтому после введения медленно высвобождается свободный белок, что позволяет избежать проблем в плане связывания с рецептором, метаболизма и почечной экскреции препарата. Из-за нестабильности связи конъюгаты должны храниться в виде порошка и растворяться непосредственно перед использованием.
PEG-IFNa-2a (Pegasys®, Hoffmann La Roche Inc.) получен путем ковалентного присоединения разветвленного PEG2-NHS массой 40 кДа с помощью амидных связей к остаткам лизина IFNa-2a. Это позволило получить смесь из четырех основных моно-ПЭГилированных изомеров на Lys31, Lys121, Lys131 и Lys134 [23]. Амидная связь обладает большей стабильностью, поэтому введенный конъюгат циркулирует неповрежденным, и именно он, а не свободный белок, взаимодействует с рецептором. Наиболее активными являются изомеры Lys31 и Lys134. PEG-IFNa-2b имеет более длительный период полураспада в сыворотке крови по сравнению с неконъюгированным белком, что объясняется большей массой полимера и стабильностью связи.
Фармакокинетика IFNa, PEG-IFNa-2b и PEG-IFNa-2a такова: период полувыведения IFNa 6–9 часов, PEG-IFNa-2a –72–96 часов, PEG-IFNa-2b – 32–40 часов; клиренс (мл/ч) 6000, 60–100 и 725; период полуабсорбции 2,4, 50 и 4,6 часа, соответственно.
Пегвисомант
Пегвисомант (Pegvisomant, Somavert®, Pfizer Inc.), первый специфический антагонист рецепторов гормона роста, разработанный для лечения акромегалии. Акромегалия – это синдром, возникающий из-за избыточной выработки гипофизом гормона роста человека (hGH, соматотропин) и характеризующийся аномальным увеличением кистей рук, стоп, черепа и челюсти. Гормон роста содержит два различных, высоко- и низкоаффинных участка связывания с рецептором. Первым мутантом гормона роста, испытанным в качестве антагониста, был G120K, в котором лизин заменен на глицин. G120K связывается с рецептором hGH с высокой аффинностью и препятствует передаче сигнала; к сожалению, как и сам гормон роста, он имеет очень короткий период полураспада, порядка 20 минут. Для того чтобы продлить время его циркуляции в плазме, была проведена случайная конъюгация с PEG 5 кДа. В результате получился белок с периодом полураспада около 100 часов, но с низким сродством к рецептору. Для решения этой проблемы были введены дополнительные мутации, чтобы уменьшить количество потенциальных сайтов связывания PEG. Из них для дальнейшей разработки был выбран B2036. B2036 является антагонистом с повышенной аффинностью на одном участке связывания и пониженной – на другом. Для того чтобы замедлить клиренс в плазме, 4–6 цепей PEG 5kDa конъюгированы к белку, увеличивая гидродинамический объем белка [24]. ПЭГилирование снизило антагонистическую активность B2036 примерно в 28 раз, но этот эффект уравновешен значительно улучшенным периодом полураспада в плазме – до 6 дней. В 2003 году FDA одобрило пегвисомант в качестве терапии второй линии для лечения акромегалии.
Цертолизумаб Пегол
В настоящее время терапия антителами используется в основном для лечения хронических заболеваний, требующих многократного введения лекарства в течение нескольких месяцев или лет, что влечет высокие затраты. Одним из подходов, используемых для повышения стабильности и снижения стоимости, является экспрессия фрагментов антител, таких как Fab’ и scFv, в микробной системе на основе Escherichia coli. Фрагменты антител обходятся дешевле в крупномасштабном производстве, но быстрее выводятся из организма, поэтому их подвергают ПЭГилированию, что улучшает период полураспада, но способность связывать антиген снижается. Это затруднение было преодолено путем сайт-специфического присоединения PEG с большой молекулярной массой к Fab’.
Цертолизумаб пегол (Certolizumab Pegol, Cimzia®, UCB S.A.) разработан на основе этой стратегии. Препарат представляет собой ПЭГилированный фрагмент Fab моноклонального антитела гуманизированного противоопухолевого фактора некроза TNFα, которое связывает и нейтрализует мембраносвязанный или растворимый TNFα. В данном случае конъюгация с разветвленным PEG2 позволяет сохранить распознающую способность, повысить время циркуляции в крови примерно до двух недель (вводят подкожно 2–4 раза в неделю) и снизить иммуногенность. Поскольку сайт-специфическое ПЭГилирование PEG2 массой 40 кДа Fab’ фрагмента направлено на участок, расположенный далеко от антигенсвязывающей области, конъюгат демонстрирует такое же сродство к TNFa, как и нативное антитело, без потери биологической активности [25].
Цертолизумаб пегол одобрен FDA в апреле 2008 года для пациентов с умеренной и тяжелой формой болезни Крона, которые не ответили на традиционную терапию, с 2013 – псориаза. В 2009 году – для лечения ревматоидного артрита в ЕС.
Альтернативная стратегия, применяемая к конъюгации антител TNF, которая не достигла маркетингового успеха, была разработана компанией Amgen Inc.. Пегсунерцепт (Pegsunercept) получен путем присоединения метокси-PEG массой 30 кДа к N-концевой группе рекомбинантного человеческого растворимого рецептора TNF типа I [26]. Анти-VEGF антитело (CDP791), конъюгированное с PEG на остатке цистеина в области петли, обладает увеличенным с 17,4 до 203 часов периодом полураспада в плазме.
PEG-уриказа
Подагра характеризуется стойкой гиперурикемией, которая приводит к отложению кристаллов мочевой кислоты в суставах и периартикулярных структурах и развитию кальцификатов мочевой кислоты в почках, вызывающих боль. С гиперурикемией могут быть связаны синдром лизиса опухоли и нарушение функции почек, что препятствует выведению мочевой кислоты. Аллопуринол, ингибитор фермента ксантиноксидазы, который катализирует последние этапы метаболизма до растворимых пуринов, введен для лечения подагры в 1960 году. Однако у некоторых пациентов наблюдалась эксфолиативная реакция на этот препарат. Поэтому, в качестве возможной альтернативой, предложили использовать уриказу (фермент, который гидролизует мочевую кислоту до более растворимого аллантоина, легко выводимого почками). Уриказа не присутствует в норме у человека, ее получают из гетерологичных источников – бактерий или животных, что привело к аллергическим реакциям. В 2002 году рекомбинантная версия, расбуриказа (Ellitek®, Sanofi-Aventis), была получена с помощью Saccharomyces cerevisiae и стала доступна в США для лечения гиперурикемии, но осталась проблема иммуногенности [27].
Исследователи предложили ПЭГилирование как средство снижения иммуногенности. PEG-уриказа (Puricase®, Mountain View Pharmaceuticals) получена путем случайного ПЭГилирования рекомбинантной уриказы млекопитающих (фермент с первичной последовательностью, аналогичной уриказе свиней) девятью полимерными цепями PEG массой по 10 кДа на субъединицу [28]. Количество и размер цепей PEG были выбраны для сохранения активности фермента и минимизации образования антиуриказных антител. Наиболее эффективной дозой является 8 мг, вводимые каждые 2 недели, с периодом полураспада ~12 дней.
Пеглотиказа (Pegloticase, Krystexxa, Horizon Pharma; Ирландия), рекомбинантная пегилированная уриказа, была одобрена FDA в 2010 году для лечения хронической подагры у взрослых пациентов, устойчивых к традиционной терапии.
Гемоглобин
Растворы модифицированного гемоглобина рассматриваются для использования в качестве ацеллюлярных переносчиков кислорода для поддержания кислородной емкости и восстановления внутрисосудистого объема при кровопотере или гемодилюции. Основным ограничением в использовании гемоглобина является его случайное проникновение в интерстициальные пространства и поглощение оксида азота. Присоединение PEG к свободному тиоловому цистеину (Cys93) с использованием малеимида PEG массой 5, 10 и 20 кДа привело к получению ПЭГилированных гемоглобинов с двумя цепями PEG на один тетрамер. Конъюгат показал небольшое увеличение связывания кислорода. Дальнейшая сайт-специфическая модификация была достигнута с помощью ПЭГальдегида для синтеза производного с шестью цепями PEG [29]. Это соединение показало высокую активность связывания кислорода по сравнению с ПЭГилированным по Cys93 белком, что указывает на роль этой аминокислоты в захвате кислорода.
ПЭГилированный препарат Sanguinate (Prolong Pharmaceuticals, США) получил от FDA статус орфанного лекарства для использования у пациентов с вазоокклюзивным кризом при серповидно-клеточной болезни [30]. Период полураспада у больных составляет около 20 часов, что в 3–4 раза больше по сравнению с незамещенным рекомбинантным белком.
ПЭГилированные биологически активные пептиды и белки
Пегинезатид (PEG-EPO)
Пегинезатид (Peginesatide, Omontys®, Affymax/Takeda; CAS 913976-27-9) – это пептидный стимулятор эритропоэза, который состоит из гомодимерного пептида, имитирующего эритропоэтин (4900 Да), соединенного с 40 кДа-разветвленным PEG для увеличения периода полураспада до 3–4 недель и меньшей иммуногенности по сравнению с другими стимуляторами эритропоэза [31]. Он демонстрирует специфическое связывание с рецептором эритропоэтина, что ведет к стимуляции эритропоэза и увеличению производства эритроцитов.
Пегиназатид был представлен в США в апреле 2012 года, однако неожиданные серьезные побочные реакции привели к быстрому отзыву пегиназатида с рынка в феврале 2013 года. Нежелательные явления заключались в анафилактоидной реакции вследствие прямой активации тучных клеток. Позже исследование показало, что эта реакция была обусловлена фенолом, используемым в рецептуре пегинезатида [32]. Было обнаружено, что очищенный активный препарат не способен вызывать дегрануляцию тучных клеток. Вероятно, производители пегинезатида попытаются улучшить рецептуру и снова вывести лекарство на рынок.
TT401, PB-119 и NLY01
TT401 (LY2944876) – аналог оксинтомодулина с двойной активностью, который разрабатывается компанией Transition Therapeutics Inc. для лечения диабета 2 типа и сопутствующего ожирения [33]. TT401 – одновременно агонист глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) и рецепторов глюкагона. Оксинтомодулин (ОХМ, глюкагон-37; HSQGTFTNDYSKYLDTRRAQDFVQWLMSTKRSGGIT; CAS 159002-68-3) представляет собой пептидный гормон естественного происхождения, состоящий из 37 аминокислот и высвобождающийся из кишечника вместе с GLP-1. Гормон является двойным агонистом, активирующим рецепторы GLP-1 и глюкагона, что приводит к снижению массы тела за счет увеличения энергозатрат и уменьшения потребления пищи. Поскольку короткий период полураспада в естественных условиях является основной проблемой для клинического применения агонистов рецепторов GLP-1 (РА GLP-1), то активно используются различные стратегии длительного действия, включая присоединение жирных кислот, слияние с сывороточным альбумином или Fc-областью моноклонального антитела, а также биодеградируемые микросферы.
На сегодняшний день три ПЭГилированных GLP-1 РА вышли в США и Китае на стадию клинических испытаний (фаза 2, NCT03520972 и NCT03604419) для лечения сахарного диабета 2 типа. PB-119 – ПЭГилированный аналог эксендина-4, в котором 23 кДа PEG-малеимид конъюгирован с терминальной группой модифицированного пептида [34]. Другой кандидат, TT223 (LY2428757), испытывается компаниями Transition Therapeutics Inc. и Eli Lilly для однократного еженедельного приема. Клиническое исследование фазы 2 было завершено в 2010 году (NCT00804986), но дальнейшая информация о статусе разработки этого продукта отсутствует.
NLY01 представляет собой сайт-специфический ПЭГилированный аналог эксендина-4, в котором аминокислота цистеин вставлена в положение 40 рядом с С-концом эксендина-4, а 50 кДа тример-структурированный PEG сайт-специфически конъюгирован с тиоловой группой С-концевого цистеина [35]. NLY01 продемонстрировал нейропротекторное действие через прямое предотвращение опосредованного микроглией преобразования астроцитов при болезни Паркинсона в нейротоксический фенотип A1 в животных моделях. NLY01 находится в фазе 1 клинического испытания для оценки безопасности, переносимости и фармакокинетических свойств (NCT03672604).
PEG-BMP-2
Примером биоактивного пептида, включенного в наночастицы бычьего альбумина, является BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2, длина 396 аминокислотных остатков, масса 44,7 кДа), который способствует формированию новой кости. Разработана система для доставки BMP-2 на основе наночастиц, стабилизированных PEG-модифицированным полиэтилениминовым покрытием. Было подсчитано, что нормальная кость содержит приблизительно 2 мг BMP-2 на килограмм измельченной ткани [36]. BMP-2 имеет очень короткий период полураспада, ~7–16 мин, и быстро разрушается in vivo. Покрытие наночастиц с помощью PEG увеличило период полураспада, но значительно снизило активность, поэтому исследователи переключились на другие варианты стабилизации BMP-2.
PEG-IGF-I (PEG-MGF)
Механический фактор роста (Mechano-growth factor, MGF, insulin-like growth factor-1Ec, IGF-1; YQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK-NH2) по строению и эффектам похож на инсулин. Фактор роста выполняет важные анаболические и гомеостатические функции в скелетных мышцах, а снижение его циркулирующего уровня связано с катаболическими состояниями.
Пептид усиливает рост мышечной ткани на животных моделях [37]. IGF-I предлагался для лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, однако возникли проблемы дозирования и нарушения гомеостаза. Период полураспада IGF-I составляет ~10 минут. Путем специфического введения PEG) к лизину 68 был разработан новый вариант IGF-I – PEG-IGF-I [38]. In vitro эта модификация уменьшила сродство к рецепторам IGF-I и инсулина, предположительно за счет снижения скорости ассоциации, и замедлила ассоциацию с IGF-I-связывающими белками, избирательно ограничивая быструю, но сохраняя устойчивую анаболическую активность. In vivo PEG-IGF-I показал увеличение периода полураспада свыше 48 часов и привлечение IGF-связывающих белков, тем самым снижая риск гипогликемии [39]. Внутримышечное введение ПЭГилированного IGF-I мышам улучшает регенерацию скелетных мышц in vivo после миотоксического повреждения [40].
Ограничения использования полиэтиленгликоля
Полиэтиленгликоль является синтетическим полимером. Он обладает свойством полидисперсности, то есть состоит из мономерных единиц различной длины. Когда PEG представлен низкомолекулярным препаратом, это создает трудности из-за полидисперсности, что приводит к проблемам в процессе связывания. Хорошо известно, что выведение полиэтиленгликоля происходит с мочой или калом, но экскреция PEG-связанных высокомолекулярных конъюгатов препаратов задерживается из-за увеличения времени пребывания, что приводит к накоплению вещества в печени, вызывая макромолекулярный синдром. При этом состоянии почкам нелегко осуществлять выведение ксенобиотика. Такая ситуация возникает из-за гидродинамических свойств PEG, поскольку гидродинамический объем полиэтиленгликоля увеличивается при контакте с водой, что приводит к снижению клиренса. Почечный клиренс зависит от молекулярной массы препарата.
Длина цепи также может постепенно уменьшаться in vivo под действием ферментов, таких как цитохром P450 или алкогольдегидрогеназа, а разветвленный PEG может терять одну цепь в результате гидролиза при анхимерном содействии, когда специфическая соседняя группа, в данном случае амид, запускает высвобождение. До сих пор для конъюгации белков использовался PEG с молекулярной массой 40 кДа. Полиэтиленгликолевая цепь может покрывать белок, защищая его от воздействия окружающей среды, что приводит к изменению связей белков и биологической активности. PEG имеет ограниченную конъюгационную способность.
Основной проблемой PEG является иммуногенность при доставке лекарств и биоконъюгации [41]. Лечение пациентов ПЭГилированными препаратами может привести к образованию антител, которые специфически распознают и связываются с PEG (т. е., анти-PEG антитела). Анти-PEG антитела также обнаруживаются у людей, которые никогда не получали PEG-препаратов, но употребляли продукты, содержащие PEG. Следовательно, введение пациентам, приобретшим такие антитела, ПЭГилированных агентов, приводит к ускоренному клиренсу, низкой эффективности препарата, гиперчувствительности и, в некоторых случаях, к опасным для жизни побочным эффектам. Тем самым сохраняется важность разработки альтернативных полимеров для замены PEG.
Иногда ПЭГ-модификация также вызывает «дилемму PEG». Суть проблемы заключается в том, что из-за стерических затруднений ПЭГилирование сильно препятствует клеточному поглощению и эндосомальному выходу лекарств. При этом, полимерные цепи могут блокировать связывание лигандов с соответствующими целевыми рецепторами на клеточной поверхности, приводя к значительной потере активности ПЭГилированного препарата и затрудняя фармакокинетику. Для преодоления «дилеммы PEG» используется обратимое ПЭГилирование, продуктом которого являются конъюгаты с нестабильной связью между цепью PEG и субстратом. Полученные таким способом препараты легко разрушаются в физиологических и патологических условиях, высвобождая активное вещество и фрагменты PEG [42]. Таким образом решается падения биологической активности ПЭГилированного лекарства.
Заключение
Доставка биофармацевтических препаратов является сложной задачей из-за физических барьеров и метаболизирующих ферментов. Белки и пептиды нестабильны и быстро деградируют в организме под действием этих факторов. В случае лекарственных препаратов, из-за этого требуется частое введение дополнительных доз.
ПЭГилирование путем присоединения одного или нескольких фрагментов PEG было разработано для увеличения времени циркуляции и маскировки макромолекулы от ферментативной атаки. Полиэтиленгликоль широко используется в различных лекарственных рецептурах.
В целом, ПЭГилирование дает три основных преимущества:
1) Улучшение фармакокинетики и фармакодинамических свойств: многократное продление периода полураспада в плазме, регулировка высвобождения лекарств в организме, снижение почечного клиренса и т.д., что позволяет вводить препарат реже и/или в меньшем количестве
2) Повышение стабильности лекарств при хранении.
3) Оптимизация распределения препарата в организме.
Будущие достижения в области PEG-модифицированных белков и пептидов ожидаются в направлении поиска или создания новых субстратов для PEG-конъюгатов. Технология введения фрагментов PEG развивается от случайного к сайт-специфическому ПЭГилированию. Сейчас она применяется к разнообразному набору терапевтических агентов, таких как нуклеотиды, аптамеры и пептиды. Многие фармацевтические компании занимаются производством PEG-препаратов, стимулируя спрос на стабильные и длительно действующие препараты.
Лечение пациентов ПЭГилированными препаратами может привести к образованию антител, что снижает эффективность и может вызывать опасные побочные эффекты. Несмотря на распространение лекарств с PEG, актуальным остается разработка альтернативных полимеров.
1. Wetzler, M., Hamilton, P., 8 — Peptides as therapeutics, in Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering, S. Koutsopoulos, Editor. 2018, Woodhead Publishing. p. 215-230.
2. Ibrahim, Y.H.E.Y., Regdon, G., Hamedelniel, E.I., Sovány, T., Review of recently used techniques and materials to improve the efficiency of orally administered proteins/peptides. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020. 28(1): p. 403-416. DOI: 10.1007/s40199-019-00316-w.
3. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R.O., Just how prevalent are peptide therapeutic products? A critical review. International Journal of Pharmaceutics, 2020. 587: p. 119491. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119491.
4. Patel, G., Misra, A., 10 — Oral Delivery of Proteins and Peptides: Concepts and Applications, in Challenges in Delivery of Therapeutic Genomics and Proteomics, A. Misra, Editor. 2011, Elsevier: London. p. 481-529.
5. Muheem, A., Shakeel, F., Jahangir, M.A., Anwar, M., Mallick, N., Jain, G.K., Warsi, M.H., Ahmad, F.J., A review on the strategies for oral delivery of proteins and peptides and their clinical perspectives. Saudi Pharmaceutical Journal, 2016. 24(4): p. 413-428. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jsps.2014.06.004.
6. Ansari, M.J., Anwer, M.K., Jamil, S., Al-Shdefat, R., Ali, B.E., Ahmad, M.M., Ansari, M.N., Enhanced oral bioavailability of insulin-loaded solid lipid nanoparticles: pharmacokinetic bioavailability of insulin-loaded solid lipid nanoparticles in diabetic rats. Drug Delivery, 2016. 23(6): p. 1972-1979. DOI: 10.3109/10717544.2015.1039666.
7. Suk, J.S., Xu, Q., Kim, N., Hanes, J., Ensign, L.M., PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery. Advanced drug delivery reviews, 2016. 99(Pt A): p. 28-51. DOI: 10.1016/j.addr.2015.09.012.
8. Abuchowski, A., McCoy, J.R., Palczuk, N.C., van Es, T., Davis, F.F., Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. Journal of Biological Chemistry, 1977. 252(11): p. 3582-3586. DOI: https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)40292-4.
9. Abuchowski, A., van Es, T., Palczuk, N.C., Davis, F.F., Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. The Journal of biological chemistry, 1977. 252(11): p. 3578-3581.
10. Weissig, V., Pettinger, T.K., Murdock, N. Nanopharmaceuticals (part 1): products on the market. International journal of nanomedicine, 2014. 9, 4357-4373 DOI: 10.2147/ijn.s46900.
11. Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y., Pharmacokinetics of Pegylated Liposomal Doxorubicin. Clinical Pharmacokinetics, 2003. 42(5): p. 419-436. DOI: 10.2165/00003088-200342050-00002.
12. Yadav, D., Dewangan, H.K., PEGYLATION: an important approach for novel drug delivery system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 2021. 32(2): p. 266-280. DOI: 10.1080/09205063.2020.1825304.
13. Bhadra, D., Bhadra, S., Jain, S., Jain, N.K., A PEGylated dendritic nanoparticulate carrier of fluorouracil. International Journal of Pharmaceutics, 2003. 257(1): p. 111-124. DOI: https://doi.org/10.1016/S0378-5173(03)00132-7.
14. Cisneros-Ruiz, M., Mayolo-Deloisa, K., Rito-Palomares, M., Przybycien, T.M., Separation of PEGylated variants of ribonuclease A and apo-α-lactalbumin via reversed phase chromatography. Journal of Chromatography A, 2014. 1360: p. 209-216. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2014.07.085.
15. Monfardini, C., Schiavon, O., Caliceti, P., Morpurgo, M., Harris, J.M., Veronese, F.M., A Branched Monomethoxypoly(ethylene glycol) for Protein Modification. Bioconjugate Chemistry, 1995. 6(1): p. 62-69. DOI: 10.1021/bc00031a006.
16. Jokerst, J.V., Lobovkina, T., Zare, R.N., Gambhir, S.S., Nanoparticle PEGylation for imaging and therapy. Nanomedicine, 2011. 6(4): p. 715-728. DOI: 10.2217/nnm.11.19.
17. Levy, Y., Hershfield, M.S., Fernandez-Mejia, C., Polmar, S.H., Scudiery, D., Berger, M., Sorensen, R.U., Adenosine deaminase deficiency with late onset of recurrent infections: Response to treatment with polyethylene glycol-modified adenosine deaminase. The Journal of Pediatrics, 1988. 113(2): p. 312-317. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-3476(88)80271-3.
18. Hak, L.J., Relling, M.V., Cheng, C., Pei, D., Wang, B., Sandlund, J.T., Rubnitz, J., Pui, C.H., Asparaginase pharmacodynamics differ by formulation among children with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 2004. 18(6): p. 1072-1077. DOI: 10.1038/sj.leu.2403351.
19. Fibbe, W.E., Daha, M.R., Hiemstra, P.S., Duinkerken, N., Lurvink, E., Ralph, P., Altrock, B.W., Kaushansky, K., Willemze, R., Falkenburg, J.H., Interleukin 1 and poly(rI).poly(rC) induce production of granulocyte CSF, macrophage CSF, and granulocyte-macrophage CSF by human endothelial cells. Experimental hematology, 1989. 17(3): p. 229-234.
20. Lu, H.S., Clogston, C.L., Narhi, L.O., Merewether, L.A., Pearl, W.R., Boone, T.C., Folding and oxidation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor produced in Escherichia coli. Characterization of the disulfide-reduced intermediates and cysteine—-serine analogs. Journal of Biological Chemistry, 1992. 267(13): p. 8770-8777. DOI: https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)50345-3.
21. Molineux, G., The Design and Development of Pegfilgrastim (PEG-rmetHuG-CSF, Neulasta®). Current Pharmaceutical Design, 2004. 10(11): p. 1235-1244. DOI: 10.2174/1381612043452613.
22. Wang, Y.-S., Youngster, S., Grace, M., Bausch, J., Bordens, R., Wyss, D.F., Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002. 54(4): p. 547-570. DOI: https://doi.org/10.1016/S0169-409X(02)00027-3.
23. Monkarsh, S.P., Ma, Y., Aglione, A., Bailon, P., Ciolek, D., Debarbieri, B., Graves, M.C., Hollfelder, K., Michel, H., Palleroni, A., Porter, J.E., Russoman, E., Roy, S., Pan, Y.-C.E., Positional Isomers of Monopegylated Interferon α-2a: Isolation, Characterization, and Biological Activity. Analytical Biochemistry, 1997. 247(2): p. 434-440. DOI: https://doi.org/10.1006/abio.1997.2128.
24. Pradhananga, S., Wilkinson, I., Ross, R.J.M., Pegvisomant: structure and function. Journal of molecular endocrinology, 2002. 29(1): p. 11-14. DOI: 10.1677/jme.0.0290011.
25. Blick, S.K.A., Curran, M.P., Certolizumab Pegol. BioDrugs, 2007. 21(3): p. 195-201. DOI: 10.2165/00063030-200721030-00006.
26. Edwards, C.K., PEGylated recombinant human soluble tumour necrosis factor receptor type I (r-Hu-sTNF-RI): novel high affinity TNF receptor designed for chronic inflammatory diseases. Annals of the Rheumatic Diseases, 1999. 58(suppl 1): p. I73. DOI: 10.1136/ard.58.2008.i73.
27. Coiffier, B., Mounier, N., Bologna, S., Fermé, C., Tilly, H., Sonet, A., Christian, B., Casasnovas, O., Jourdan, E., Belhadj, K., Herbrecht, R., Efficacy and Safety of Rasburicase (recombinant urate oxidase) for the Prevention and Treatment of Hyperuricemia During Induction Chemotherapy of Aggressive Non-Hodgkin’s Lymphoma: Results of the GRAAL1 (Groupe d’Etude des Lymphomes de l’Adulte Trial on Rasburicase Activity in Adult Lymphoma) Study. Journal of Clinical Oncology, 2003. 21(23): p. 4402-4406. DOI: 10.1200/JCO.2003.04.115.
28. Sundy, J.S., Ganson, N.J., Kelly, S.J., Scarlett, E.L., Rehrig, C.D., Huang, W., Hershfield, M.S., Pharmacokinetics and pharmacodynamics of intravenous PEGylated recombinant mammalian urate oxidase in patients with refractory gout. Arthritis & Rheumatism, 2007. 56(3): p. 1021-1028. DOI: https://doi.org/10.1002/art.22403.
29. Hu, T., Prabhakaran, M., Acharya, Seetharama A., Manjula, Belur N., Influence of the chemistry of conjugation of poly(ethylene glycol) to Hb on the oxygen-binding and solution properties of the PEG-Hb conjugate. Biochemical Journal, 2005. 392(3): p. 555-564. DOI: 10.1042/BJ20050663.
30. Khan, F., Singh, K., Friedman, M.T., Artificial Blood: The History and Current Perspectives of Blood Substitutes. Discoveries (Craiova, Romania), 2020. 8(1): p. e104-e104. DOI: 10.15190/d.2020.1.
31. Fishbane, S., Schiller, B., Locatelli, F., Covic, A.C., Provenzano, R., Wiecek, A., Levin, N.W., Kaplan, M., Macdougall, I.C., Francisco, C., Mayo, M.R., Polu, K.R., Duliege, A.-M., Besarab, A., Peginesatide in Patients with Anemia Undergoing Hemodialysis. New England Journal of Medicine, 2013. 368(4): p. 307-319. DOI: 10.1056/NEJMoa1203165.
32. Weaver, J.L., Boyne, M., Pang, E., Chimalakonda, K., Howard, K.E., Nonclinical evaluation of the potential for mast cell activation by an erythropoietin analog. Toxicology and Applied Pharmacology, 2015. 287(3): p. 246-252. DOI: https://doi.org/10.1016/j.taap.2015.06.009.
33. Park, E.J., Lim, S.M., Lee, K.C., Na, D.H., Exendins and exendin analogs for diabetic therapy: a patent review (2012-2015). Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2016. 26(7): p. 833-842. DOI: 10.1080/13543776.2016.1192130.
34. EP 2423223 B1, 2015.
35. Kim, T.H., Jiang, H.H., Lim, S.M., Youn, Y.S., Choi, K.Y., Lee, S., Chen, X., Byun, Y., Lee, K.C., Site-Specific PEGylated Exendin-4 Modified with a High Molecular Weight Trimeric PEG Reduces Steric Hindrance and Increases Type 2 Antidiabetic Therapeutic Effects. Bioconjugate Chemistry, 2012. 23(11): p. 2214-2220. DOI: 10.1021/bc300265n.
36. Zhang, S., Kucharski, C., Doschak, M.R., Sebald, W., Uludağ, H., Polyethylenimine–PEG coated albumin nanoparticles for BMP-2 delivery. Biomaterials, 2010. 31(5): p. 952-963. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.10.011.
37. Goldspink, G., Research on mechano growth factor: its potential for optimising physical training as well as misuse in doping. British journal of sports medicine, 2005. 39(11): p. 787-788. DOI: 10.1136/bjsm.2004.015826.
38. Metzger, F., Sajid, W., Saenger, S., Staudenmaier, C., van der Poel, C., Sobottka, B., Schuler, A., Sawitzky, M., Poirier, R., Tuerck, D.J.J.o.B.C., Separation of fast from slow anabolism by site-specific PEGylation of insulin-like growth factor I (IGF-I). 2011. 286(22): p. 19501-19510.
39. WO 2009121759 A2, 2009.
40. Martins, K.J.B., Gehrig, S.M., Naim, T., Saenger, S., Baum, D., Metzger, F., Lynch, G.S., Intramuscular administration of PEGylated IGF-I improves skeletal muscle regeneration after myotoxic injury. Growth Hormone & IGF Research, 2013. 23(4): p. 128-133. DOI: 10.1016/j.ghir.2013.03.002.
41. Hoang Thi, T.T., Pilkington, E.H., Nguyen, D.H., Lee, J.S., Park, K.D., Truong, N.P., The Importance of Poly(ethylene glycol) Alternatives for Overcoming PEG Immunogenicity in Drug Delivery and Bioconjugation. Polymers, 2020. 12(2). DOI: 10.3390/polym12020298.
42. Wawro, A.M., Aoki, Y., Muraoka, T., Tsumoto, K., Kinbara, K., Enzymatically cleavable traceless biotin tags for protein PEGylation and purification. Chemical Communications, 2018. 54(15): p. 1913-1916. DOI: 10.1039/C7CC05814D.
